对应练习：
抗除草剂转基因作物的推广可有效减轻除草劳动强度、提高农业生产效率。图1为抗除草剂转基因玉米的技术流程。
（1）构建含除草剂抗性基因的表达载体，传统的方法是目的基因通过__________酶与载体进行重组。另外，可通过________技术在目的基因两侧添加相应限制酶识别序列，以便构建表达载体。
（2）科研人员研发了新的DNA重组方法——无缝克隆In-Fusion技术，如图2所示。In-Fusion酶能够识别任何具有相同15bp末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，据此实现目的基因和载体的连接。和传统方法比，无缝克隆In-Fusion技术的优点是________________。
①应用以上方法构建含有A基因和GUS基因的重组DNA分子时，首先获得了图3中的3种DNA分子，然后混合进行In-Fusion反应。如果引物2上额外添加的片段与GUS基因e片段（图中加粗表示）序列相同，那么引物1和引物4上额外增加的片段分别与载体中的片段（图中加粗表示）________相同。完成重组反应后，将表达载体导入农杆菌中。
②为筛选成功转入目标重组DNA分子的菌落，可以选取引物________扩增目的基因并电泳检测。
（3）农杆菌转化愈伤组织时，常用含除草剂的选择培养基筛选转化的愈伤组织。由于愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未成功转化的愈伤组织也可能在选择培养基上生长。针对上述现象，可以在选择培养基中同时加入无色物质K进行筛选，其中周围的培养基显（填“显”或“不显”）蓝色的愈伤组织是转化成功的，原因是________________。
答案解析
解：（1）构建含除草剂抗性基因的表达载体，需要用限制酶切割目的基因和运载体，而后通过DNA连接酶将目的基因和载体进行重组。载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列不能出现在目的基因内部，否则会导致目的基因被破坏，为了构建目的基因两端的限制酶识别序列，可通过PCR技术在目的基因两侧添加相应限制酶识别序列来实现。
（2）①科研人员希望应用以上方法构建含有A和GUS基因的重组DNA分子，首先获得了3种DNA分子如图3，然后混合进行In-Fusion反应。如果引物2上额外添加的片段对应于GUS基因中加粗的e片段，说明A基因合GUS基因通过e片段实现连接（我的理解：这部分e因相同，因而可以重组替换，详见下面红字说明），则引物1和4将产生与载体相连接的片段，因此，那么引物1和引物4上额外增加的片段分别对应载体中的片段a、d。完成重组反应后，将产物表达载体加入经过Ca2+处理的农杆菌中，因为此时的农杆菌处于感受态，转化的成功率较高。（我的理解：引物1与其母链形成的DNA要与载体ab|cd[现以ab为例说明]加粗部分进行重组替换，根据其5'-3'方向，引物1与a相同即可重组替换，其他类似。这种解释，利用了前面交待的重组替换这一技术，参照图2比较明显，相同片段可替换，则只需再考虑一下链的方向即可）
②为筛选成功转入目标重组DNA分子的菌落，可以选取引物1和4扩增目的基因并电泳检测，若成功导入目的基因，则会存在基因A和GUS发生融合的基因，若检测阳性，则说明转基因成功。
（3）农杆菌转化愈伤组织时，需要用含除草剂的选择培养基筛选转化的愈伤组织，能在该培养基上正常生长的愈伤组织为具有对除草剂的抗性；愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织（假阳性）也可能在选择培养基上生长。由于成功实现转化的愈伤组织中具有抗除草剂的基因，也有GUS基因，而报告基因GUS表达产物能催化无色物质K呈现蓝色，因此用无色物质K分别处理上述的愈伤组织，出现蓝色的是无农杆菌附着的转化愈伤组织和无蓝色的是假阳性的农杆菌，这里依据的原理是GUS基因在真核细胞中表达，而在农杆菌中不表达。
故答案为：
（1）限制酶、DNA连接 PCR
（2）插入位点不受限制酶识别序列限制，实现了目的基因在载体任意位点上的插入（合理即可）
①a（d） d（a）
②1、4
（3）无色物质K 显
转化成功的愈伤组织中，GUS基因正确表达，表达产物能催化培养基中的无色物质K呈现蓝色；农杆菌中的GUS由于含有内含子转录序列不能切除，不能正确表达，不能催化培养基中的无色物质K呈现蓝色
解析
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：
①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；
②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；
③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。