最后附有某次PCR详细过程
白细胞介素 12（IL-12）是免疫应答中的异二聚体糖蛋白，由 p35和 p40两个亚基经两个二硫键共价结合而成，对人体抗癌免疫系统有非常重要的调节作用。由于 p35和 p40基因分别定位于不同的染色体，两基因同时表达且 p40和 p35以 1：1的比例形成的异二聚体才具有生物活性。若两基因表达效率不同，则形成的 IL-12二聚体的活性大大降低，尤其是当 p40基因过量表达时，p40单体或其二聚体会明显抑制IL-12的活性。为避免上述不利情况的发生，科学家尝试用下图所示方案构建了含有 p40和 p35 cDNA序列的 IL-12融合基因。其中P1、P2、P3、P4为 PCR引物。P2和 P3除含有与 p40基因和 p35基因互补的碱基序列外，在5’端含有 36个组成 Linker的碱基序列，它们之间有 27个碱基互补。
（1）PCR需要的外在条件是________，它可特异性地快速扩增目的基因，该技术的特异性体现在________。
（2）构建IL-12融合基因时，首先利用引物 P1、P2扩增 p40基因，利用引物 P3、P4扩增p35基因，然后经过一个循环的变性、退火和延伸，即通过重叠延伸法得到少量的 IL-12融合基因。之后，以________为引物，大量扩增出IL-12融合基因。据图分析 IL-12融合基因中的Linker序列共有________对碱基。
（3）已知限制酶 XhoI的识别序列：5'-C'TCGAG-3' NheI的识别序列：5'-G'CTAGC3’，根据下表中相关引物的碱基序列，判断引物 P1和 P4中分别引入限制酶________的序列，P3的5’端的前10个碱基序列是________。
引物 | 碱基序列 |
P1 | 5’CTAGCTAGCGATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCT3’（35个碱基） |
P2 | 5'ACCACCAGAGCCCCCGCCCCCGCTTCCTCCTCCTCCACTGCAGGGCACAGATGCCCATT3'（59个碱基） |
P4 | 5’CGCCTCGAGTTATTAGGAAGCATTCAGATAG3’（31个碱基） |
（4）科学家将构建成功的 IL-12融合基因（共有 1630个碱基对，其中没有内含子）转染树突状细胞（DC），请利用 PCR技术检测 IL-12融合基因是否表达出 mRNA．实验设计思路是______。
【答案】（1） ①.高温、引物、原料、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+等 ②. 引物与模板DNA结合的特异性
（2） ①. P1、P4 ②. 45
（3） ①. NheI、XhoI ②. 5’-GGAAGCGGGG- 3’
（4）提取转染DC细胞中的总RNA，进行反转录获得cDNA，以cDNA为模板，P1、P4为引物进行PCR扩增，检测扩增产物中是否出现1630个碱基对的扩增产物
【解析】
【分析】PCR反应过程：变性→复性→延伸。变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸：72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
【小问1详解】
PCR全称聚合酶链式反应，该反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶，需要Mg2+激活DNA聚合酶活性，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，引物与模板DNA结合的特异性体现了PCR的特异性。
【小问2详解】
据题意可知，P2 和P3 之间有27 个碱基互补，那么通过重叠延伸法得到少量的IL-12 融合基因27bp位置是互补位置，应该是P2 和P3 位置，又因为DNA聚合酶只能从引物3'端开始延伸DNA链，因此通过重叠延伸法得到少量的IL-12 融合基因需要以P1、P4为引物，才能大量扩增出IL-12 融合基因。P2 和P3的5’端含有36 个组成Linker 的碱基序列，它们之间有27 个碱基互补，因此IL-12 融合基因中的Linker序列共有（36-27）+27+（36-27）=45对碱基。
【小问3详解】
DNA聚合酶需要在引物的3'端延伸子链，因此限制酶序列只能添加在引物的5'端，限制酶XhoI的识别序列：5'-C'TCGAG-3'，如果添加在引物的5'端，那么5'端应该有序列5'-CTCGAG-3'，观看表格可知，P4的5'端存在这样序列，因此P4中引入的是限制酶XhoI的序列；同理，NheI的识别序列：5'-G'CTAGC3’，如果添加在引物的5'端，那么5'端应该有序列5'-GCTAGC-3'，观看表格可知，P1的5'端存在这样序列，因此P1中引入的是限制酶NheI的序列。据题意可知，P2和P3之间有27个碱基互补，P2的序列为5'ACCACCAGAGCCCCCGCCCCCGCTTCCTCCTCCTCCACTGCAGGGCACAGATGCCCATT3'，前面27个碱基与P3互补，因此P3中前27个碱基为3' TGGTGGTCTCGGGGGCGGGGGCGAAGG5'，即P3 的5’端的前10个碱基序列是5'-GGAAGCGGGG- 3'。
【小问4详解】
因为IL-12融合基因有1630个碱基对，没有内含子，如果利用PCR 技术检测IL-12 融合基因是否表达出mRNA，可以提取转染DC细胞中的总RNA，进行反转录获得cDNA，以cDNA为模板，P1、P4为引物进行PCR扩增，检测扩增产物中是否出现1630个碱基对的扩增产物。
附：图解，如果有一侧（比如右侧不等长）则需要2次PCR得到目标DNA
